Пневмококки микробиология. Микробиология с техникой микробиологических исследований - пневмококки. Восстановление нормальной микрофлоры кишечника

Streptococcuspneumoniae - грамположи-тельные диплококки, обычно ланцетовидные или располагающиеся в виде цепочек, имеющие полисахаридную капсулу, которая позволяет легко «типировать» их специфическими антисыворотками. Пневмококки неподвижны, спор не образуют; факультативные анаэробы. При культивировании на искусственных питательных средах теряют капсулу, переходят из S- в R-форму. Хорошо растут на кровяных и сывороточных средах. Высоковирулентны для белых мышей (сепсис). По капсульному антигену пневмококки делятся на 85 сероваров.

Роль в патологии человека является естественным обитателем верхних дыхательных путей человека. Streptococcus pneumoniae может вызывать пневмонию, обычно лобарную, синусит и средний отит, менингит, который чаще всего является вторичным. Также может вызывать остеомиелит, септический артрит, эндокардит, перитонит, целлюлит и абсцессы мозга. Streptococcus pneumoniae является лидером среди инвазивных инфекций как среди молодых, так и у пожилых людей.

Бактериологический Подходящим для проведения анализа считается образец мокроты, собранный до начала антибиотикотерапии, полученный при глубоком откашливании и удовлетворяющий следующим критериям, исследования мокроты должно быть выполнено не позднее 2 ч после ее получения.

Бактериоскопический -ммазок мокроты окраска по граму.

Главными факторами патогенности пневмококка считают капсулу и субстанцию С.

Капсула пневмококка - основной фактор вирулентности. Она защищает бактерии от микробицидного потенциала фагоцитов и действия опсонинов. Некапсулированные штаммы пневмококка практически авирулентны, их обнаруживают редко. Большую часть пула противопневмококковых AT составляют AT к Аг капсулы.

12.Роль стрептококков при скарлатине. Патогенез заболевания, иммунитет, определение его напряженности (реакция Дика).

Скарлатина- острое инфекционное заболевание, характерезующееся ангиной, общей интоксикацией, появлением почечных высыпаний красного цвета на шее и груди.

Возбудитель скарлатины- S. pyogenes.

Патогенез и клиника. Входные ворота инфекции- слизистая оболочка зева. Источником инфекции являются больные, реконвалесценты и бактерионосители. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Поражаются в основном дети в возрасте от 1 года до 5 лет выделяют два периода течения инфекции: первый - токсический, сопровождается появлением сыпи; второй характеризуется аллергическими реакциями. В патогенез скарлатины играет роль не только эритрогенный токсин но и сам микроб.

Иммунитет. После перенесенного заболевания прочный, преимущественно антитоксический. Повторные заболевания встречаются крайне редко.

Микробиологическая диагностика. Обычно диагноз устанавливают по клинической картине. В сомнительных случаях используют:

1) реакцию Дика ; бывает положительной. В результате перенесенного заболевания вырабатывается антитоксический иммунитет и реакция становится отрицательной. Применение чистого токсина, очищенного от белковой фракции, в реакции Дика дает постоянно четкие результаты и свидетельствует о специфичности этой реакции при скарлатине

2) феномен погашения сыпи (внутрикожное введение 0,1 мл антитоксической сыворотки реконвалесцента);

3) выделение гемолитического стрептококка из зева;

4) обнаружение в моче, больных специфических преципитинов.

Профилактика и лечение. Основные меры профилактики сводятся к своевременному выявлению больных, их госпитализации, проведению карантинных мероприятий. Контактным ослабленным детям вводят 1,5-3 мл гамма-глобулина. Несмотря на многочисленные попытки, получить эффективную вакцину против скарлатины не удалось.

Реакция Дика : внутрикожная проба(вид кожной аллергической пробы, при которой аллерген вводится внутрикожно.) с очищенным стрептококковым токсином, применяемая в диагностике скарлатины и при определении восприимчивости к ней.

13.Менингококки, классификация, серологические группы, характеристика биологических свойств, факторы патогенности, патогенез инфекции. Лабораторная диагностика различных клинических форм менингококковой инфекции, бактерионосительство, специфическая профилактика.

Возбудитель менингококковой инфекции относится к семейству Neisseriaceae, роду Neisseria, вид - N. meningitidis. Менингококки – грамотрицательные диплококки в виде кофейного зерна, часто внутри лейкоцитов – незавершенный фагоцитоз. Спор и жгутиков не имеют, образуют капсулу. Они строгие аэробы. Растут на средах с добавлением сыворотки, при температуре 37⁰, образуя S формыколоний(мелкие, нежные, бесцветные). Ростстимулируется повышенной концентрацией СО2 и повышенной влажностью. Ферментируют глюкозу, мальтозу, оксидазоположительны.

Имеют капсульные полисахаридные антигены, по которым менингококки делятся на серогруппы, белковые типовые антигены, общий белковый видоспецифический антиген и липополисахаридные антигены – 8 серотипов.

Факторы патогенности:

1. Пили и белки наружной мембраны – факторы адгезии и колонизации

2. Гиалуронидаза и нейраминидаза – факторы инвазии

3. Капсула – защита от фагоцитоза

4. ЛПС – обладает токсичностью, пирогенностью, некротическим и летальным действием.

Патогенез Заражение происходит воздушно-капельным путем. Входные ворота – носоглотка, отсюда менингококки проникают в лимфатические сосуды и в кровь. Менингококки вызывают следующие клинические формы инфекции: назофарингит, менингококцемия, эпидемический цереброспинальный менингит, менингококковый эндокардит. После перенесенного заболевания формируется стойкий длительный иммунитет против всех серогрупп менингококков.

Для лабораторной диагностики менингококковой инфекции применяют:

Бактериологический метод , при котором выделяют чистую культуру из патологического материала (кровь, ликвор, экссудат, слизь из зева и носоглотки).

Серологический – антитела выявляют в РПГА и ИФА.

Собственно иммунный – антиген выявляют в ИФА

Микроскопический - мазок, приготовленный из спинномозговой жидкости окрашивают по Граму. Нахождение в мазке большого количества лейкоцитов и наличие в них грамотрицательных диплококков позволяет подтвердить диагноз – менингококковый менингит.

В качестве специфической профилактики предложены вакцины, содержащие полисахаридные антигены различных серогрупп, но они формируют лишь группоспецифический иммунитет.

Лечение – антибиотики(б-лактамы, пенициллины, цефалоспорины.)

14.Возбудители раневой анаэробной инфекции: клостридии и бактероиды. Их классификация, характеристика биологических свойств, факторы патогенности. Патогенез раневой инфекции, методы лабораторной диагностики, специфическая профилактика и терапия.

Клостридия. Раневая инфекция, вызываемая бактериями рода Clostridium (C.perfringens, C.septicum, C.novyi, C.histolyticum и др.), называется газовойгангреной.

Морфология и культивирование

Грамположительные спорообразующие палочковидные бактерии, в поражённых тканях образуют капсулу.

Облигатные анаэробы.

Факторы патогенности

Продуцируют экзотоксины, специфические для каждого вида, воздействующие на ЦНС.

Образуют ферменты агрессии – коллагеназу, протеазы, гиалуронидазу, дезоксирибонуклеазу, гемолизины.

Резистентность и экология

Возбудители газовой гангрены являются нормальными обитателями кишечника. человека и животных, споры с фекалиями попадают в окружающую среду, где сохраняют жизнеспособность десятилетиями.

Споры возбудителя устойчивы к кипячению и дезинфектантам

Эпидемиология

Газовая гангрена распространена повсеместно, особенно часто регистрируется при массовых ранениях и травмах (войны, катастрофы) и несвоевременной хирургической обработке ран.

Патогенез и клиническая картина

Газовая гангрена развивается в результате попадания спор возбудителя в рану, особенно при наличии в ране некротизированных тканей, снижении резистентности организма. Вегетативные формы клостридий образуют токсины и ферменты, повреждающие ткани организма.

Инкубационный период 1- 3 дня. Клиническая картина разнообразная и сводится к отёку, газообразованию в ране, нагноению с интоксикацией. Течение инфекции осложняет вторичная инфекция (стафилококки, протеи, кишечная палочка, бактероиды и др.)

Иммунитет

Перенесённая инфекция не создаёт иммунитет. Ведущая роль принадлежит антитоксическому иммунитету.

Микробиологическая диагностика

Исследуют кусочки поражённых тканей, раневое отделяемое, кровь. Проводят микроскопию.

Бактериологические исследования проводят в анаэробных условиях; идентификация токсина с помощью РН на мышах с диагностическими противогангренозными антитоксическими сыворотками.

Лечение и профилактика

Лечение включает хирургическое иссечение всех омертвевших тканей, антибиотики широкого спектра действия и введение протвогангренозной антитоксической лечебную сыворотки.

Профилактика – правильная хирургическая обработка ран, соблюдение асептики и антисептики при операциях; для активной иммунизации применяют анатоксины против газовой гангрены в составе секстаанатоксина, такая вакцинация проводится по специальным показаниям (военнослужащие, землекопы и др.)

Неспоробразующие анаэробы (неклостридиальные ) – это грамотрицательные (бактероиды, фузобактерии, вейлонеллы и др.) и грамположительные (актиномицеты, пептококки, пептострептококки и др.), палочковидные и кокковидные бактерии с разнообразными биологическими свойствами. Составляют обширную группу облигатных анаэробов. Состоящую из различных таксономических групп.

Культивируются в строгих анаэробных условиях, быстро погибают в присутствии кислорода.

Отличаются полиморфизмом.

Разнообразной биохимической активностью.

Антигенные свойства недостаточно изучены.

Факторы патогенности: капсула, ферменты агрессии, ЛПС клеточной стенки у грамотрицательных бактерий.

Чувствительность к антибиотикам индивидуальная у каждого вида. Некоторые представители чувствительны к метронидазолу (трихополу), клиндамицину и некоторым другим препаратам широкого спектра действия.

Неспорообразующие анаэробы являются представителями нормальной микрофлоры человека. Особенно обильно обсеменены ими слизистые оболочки ротовой полости, толстой кишки и половых органов у женщин.

Заболевания чаще всего имеют эндогенное происхождение и возникают на фоне снижения резистентности организма.

патогенез Неспорообразующие анаэробы вызывают разнообразные по клинике заболевания: гнойно-воспалительные заболевания челюстно-лицевой области, поражают мочеполовую систему, опорно-двигательную систему, печень, вызывают аппендицит, перитонит, сепсис.

Обычно это смешанные инфекции, вызываемые ассоциациями анаэробов и аэробов.

Иммунитет слабо изучен.

диагностика Проводят микроскопические исследования и бактериологические, применяют газово-жидкостную хроматографию, ИФА и др.

Лечение часто хирургическое в сочетании с антибактериальной терапией (метранидазолом, клиндамицином, цефалоспоринами, левомицетином, эритромицином).

Специфическая профилактика отсутствует.

Пневмококки. Общая характеристика

Пневмококки – это внеклеточные гноеродные грамположительные, неподвижные, неспорообразующие микроорганизмы. Температурный оптимум 37°С, лучше растут на слабощелочных средах. Поскольку пневмо-кокки продуцируют большое количество молочной кислоты, среда для их культивирования должна обладать хорошей буферной емко-стью. Более обильный рост наблюдается на средах с добавлением гормонов или на кровяном агаре.

Streptococcus pneumoniae, хорошо изученный как основной возбуди-тель пневмонии, в типичных случаях представлен расположенными попарно ланцетовидными кокками (диплококки). В организме чело-века, или в секрете респираторного тракта пара микробов обычно окружена капсулой. Могут быть обнаружены и единичные клетки, короткие цепочки.

Пневмококки растут одинаково хорошо и в присутствии и в отсут-ствие кислорода. Недостаток ферментов каталазы и пероксидазы требует особых сред, так как в обычных условиях культивирования может накапливаться Н 2 О 2 в токсичных концентрациях. Каталаза может быть получена пневмококками из эритроцитов при культи-вировании на кровяном агаре.

Вирулентные, имеющие капсулу штаммы в аэробных условиях об-разуют на поверхности кровяного агара блестящие куполообразные колонии диаметром от 0,5 до 3 мм, окруженные зеленой зоной не-полного гемолиза. При длительном культивировании на искусст-венной среде пневмококки утрачивают способность к образованию капсулы. Они не отличаются устойчивостью и не могут существо-вать вне организма. В аэрозоле, возникающем при выделении кок-ков изо рта и носа, они сохраняются на свету не более 1,5 часов. В цельной мокроте – до 1 месяца. Неустойчивы к высушиванию при комнатной температуре и более чувствительны, чем другие бакте-рии, к дезинфицирующим веществам. При температуре 52°С разру-шаются в течение 10 минут.

Если активированы аутолитические ферменты, то пневмококки про-являют значительную способность к аутолизу (саморазрушению). На этом основано применение теста лизиса бактериальных клеток в присутствии желчи, который позволяет отличить пневмококки от других α-стрептококков. Соли желчи, являясь поверхностно-активными агентами, легко инициируют эту реакцию у пневмокок-ков и очень редко у других кокков. Практически, если идентифици-руемый микроорганизм не разрушается желчью, это не пневмококк.

Пневмококки. Типы (серовары).

Пневмококки сходны по морфологическим и культуральным свой-ствам, но иммунологические различия у них отчетливо выражены. Это открытие было сделано в 1910 году, когда различными культу-рами пневмококков были иммунизированы животные, и сыворотка крови этих животных была использована для агглютинации пневмококков, выделенных из многих других источников.

При росте пневмококки имеют тенденцию выделять водораствори-мые капсульные полисахариды. Говоря об этих специфических рас-творимых субстанциях (SSS) имеют в виду типовые характеристики пневмококков. Они могут быть определены в реакции преципита-ции с культурой пневмококка, а также в крови и моче больных пневмонией.

Описано не менее 88 вариантов и субвариантов. Все могут вызывать пневмонию. Почти 80% всех случаев пневмонии вызываются пнев-мококком. У взрослых – варианты 1, 2, 3, 4, 6, 7, 14, 18 и 19; у де-тей первичную пневмонию вызывают типы 19, 23, 14, 3, б и 1 (по убывающей частоте).

Пневмококк 3 варианта наиболее вирулентен и отличается от дру-гих плотной капсулой и слизистым ростом на питательной среде. Он не имеет ланцетовидной формы. Наличие капсулы и определяет более высокую вирулентность 3 варианта и большую частоту фатальных исходов от вызываемой им пневмонии. Этот вариант наиболее опасен для пожилых пациентов.

Пневмококки. Токсические продукты

Пневмококки имеют факторы вирулентности, главным из них является капсула, блокирующая фагоцитоз. Вирулентные капсульные штаммы обра-зуют гладкие колонии, авирулентные бескапсульные варианты – шероховатые.

Антифагоцитарная активность связана с кислой природой капсуль-ного вещества в сочетании с особыми гидрофильными свойствами, благодаря чему в жидкой среде поглощенные фагоцитами кокки не подвергаются расщеплению и перевариванию. Наоборот, капсульные кокки, находящиеся на поверхности слизистой, легко фагоцитиру-ются.

Предшествующие заболевания легких, например, первичная вирус-ная инфекция, сопровождаются гиперсекрецией слизистой. Разжи-женный секрет не позволяет фагоцитам справляться с капсульными кокками и последние получают возможность интенсивной колони-зации и инвазии клеток.

Пневмококки можно рассматривать как пример патогенного микро-организма, у которого высокая инвазивность сочетается с мини-мальной токсигенностью. Однако, некоторые особенности клиники пневмококковой инфекции указывают на токсемию, несмотря на то, что собственно токсин никогда не удавалось выявить. Пневмококки вырабатывают гемолизины, лейкоцидины, отдельные некротические субстанции, а также нейраминидазу, которая дейст-вует на клеточные мембраны слизистой «носоглотки и бронхов. Мно-гие штаммы продуцируют гиалуронидазу, способствующую распро-странению в тканях.

Пневмококки. Патология инфекции

Пневмококки – наиболее частая причина пневмонии, менингита и воспаления среднего уха. При пневмококковой инфекции наиболее характерным признаком повреждения ткани является присутствие сгустков фибрина в очаге воспаления. При лобарной пневмонии много фибрина в легких; при пневмококковом менингите - много фибрина накапливается в субарахноидальном пространстве.

Пневмония – это воспаление альвеол, бронхиол и мелких бронхов, при котором пораженные участки заполняются фибринозным экссу-датом. Уплотнение (рентгенологически – «затемнение») – результат заполнения воздушных полостей легких этим экссудатом.

Пневмококки обычно вызывают 2 типа пневмоний:
1. Лобарная (долевая) пневмония, включающая от 1 до 5 больших анатомических структур (долей) легких;
2. Бронхопневмония, захватывающая терминальные бронхиолы и прилегающие доли.

Сливная бронхопневмония есть результат слияния очагов бронхоп-невмонии.

Лобарная пневмония – тяжелая токсическая болезнь, проявлением которой является учащенное поверхностное дыхание, тахикардия, цианоз, тошнота и кашель. В крови – лейкоцитоз (30000-40000 /мм3), 90-95% составляют полиморфонуклеарные нейтрофилы. Ха-рактерно также воспаление плевры - плеврит.

С разрешением воспалительного процесса и выздоровлением, экссу-дат в легких разжижается и удаляется, частично рассасыванием, частично отхаркиванием. Воздухообмен в пораженных долях вос-станавливается и легкие возвращаются в исходное состояние.

Изредка замедленное рассасывание приводит к формированию абс-цесса или хронической пневмонии (нерассасывающийся экссудат). С разжижением и рассасыванием пораженные участки замещаются фиброзной тканью, отвердевают. С внедрением интенсивной анти-микробной терапии такие драматические исходы редки.

95% всех случаев лобарной пневмонии – это пневмония, вызванная пневмококком.

Бронхопневмонию обычно вызывает пневмококк, но могут и другие микробы, например, стрептококки, стафилококки, гемофильная па-лочка, изолированно или сочетанно (микст-инфекция).

Бронхопневмония, чаще вторичная, чем первичная - это серьезное осложнение кори, гриппа, коклюша, хронических болезней сердца, сосудов, легких и почек. Наибольшее число случаев приходится на первые и последние годы жизни. Часто это заболевание является терминальным событием у лиц, ослабленных другими болезнями. Бронхопневмония может быть следствием применения анестетиков или аспирации инфицированного материала в легкие во время операции. У новорожденных это заболевание может быть связано с аспирацией инфицированной амниотической жидкости.

В отличие от лобарной пневмонии, при бронхопневмонии имеются рассеянные мелкие очаги воспаления, наиболее частые – у корня легкого. Экссудат состоит из лейкоцитов, жидкости и бактерий, но не содержит фибрина и мало эритроцитов. Плеврит и эмпиема – это осложнения. Довольно часто наблюдается хроническое течение. Застойная пневмония – это бронхопневмония, осложняющая сер-дечную недостаточность.

Пневмококки могут также быть причиной воспаления среднего уха, менингита. Известны случаи возникновения пневмококкового эндо-кардита, артрита, перитонита, кератита и др.

Пневмококки. Источники и пути передачи инфекции

Лобарная (долевая) пневмония — обычно эндемичное заболевание человеческой популяции. Как эпидемическое – оно встречается ред-ко и лишь как осложнение болезней, сопровождающихся снижением резистентности. Источниками инфекции являются больные актив-ной формой и носители.

Пневмококки проникают в организм и выделяются одним и тем же путем – воздушно-капельным. Инфекция обычно передается непо-средственно при вдыхании бактерий, выделяемых больными или носителями из носа и рта с капельками влаги. Возможна и непря-мая передача, при контакте с зараженными объектами.

Практически у каждого человека может быть неоднократное кратко-временное носительство пневмококка. При контакте с больным носительство может длиться от нескольких дней до нескольких не-дель. У носителей, не связанных с контактом с больными, как пра-вило, выделяются маловирулентные штаммы, не встречается носи-тельство наиболее опасного 3 варианта.

Пневмококки. Лабораторный диагноз инфекции

Пневмококки могут быть обнаружены в мокроте и других биологи-ческих жидкостях, если они содержатся в мокроте в большом количестве, прямой микроскопией мазков, окрашенных по Граму.

Для быстрой диагностики могут быть использованы современные методы обнаружения антигенов и антител (иммуноферменгный ана-лиз – ИФА, полимеразная цепная реакция – ПЦР и др.).

Подтверждающим методом является выделение чистой культуры и заражение ею белых мышей, которые высокочувствительны к пнев-мококкам. Смерть животных в течение 16-20 часов после заражения вызывают только вирулентные штаммы. Бескапсульные штаммы не вызывают гибели животных.

Типирование необходимо, прежде всего, для установления, какой из высоковирулентных пневмококков присутствует в патологическом материале. Для этого можно использовать методы, основанные на действии агглютинирующих и преципитирующих типоспецифических сывороток, полученных путем иммунизации животных против разных вариантов пневмококков.

По методу, разработанному Нейфилд (Neifeld), мазок мокроты или другого ис-пытуемого материала смешивается с типоспецифическими сыворот-ками. Если тип пневмококка соответствует сыворотке, его капсула быстро набухает, так как вследствие реакции антиген-антитело рез-ко меняется плотность капсульного вещества. Это явление получило название «реакция набухания по Neifeld».

Если в мокроте мало пневмококков или повторное типирование не дает результата, исследуемым материалом можно заразить внутрибрюшинно белых мышей и через несколько часов использовать для типирования перитонеальный экссудат.

Пневмококки. Отличие от других стрептококков

Практически используются следующие характеристики:
1. На кровяном агаре пневмококки дают неполный гемолиз;
2. Пневмококки в тканях и жидкостях организма имеют капсулу, стрептококки – крайне редко;
3. Если 1 часть желчи добавить к 3 частям жидкой культуры, пневмококки растворяются, стрептококки – нет;
4. Пневмококки ферментируют инулин, стрептококки – нет;
5. Пневмококки более патогенны для белых мышей, чем стрепто-кокки;
6. Для более детальной дифференциации используется агглютина-ция и преципитация со специфическими сыворотками.

Пневмококки. Иммунитет при инфекции

Естественный иммунитет у человека достаточно высок. Пневмокок-ковая пневмония в большинстве случаев развивается у лиц со сни-женной резистентностью. Перенесенное заболевание приводит к развитию иммунитета к тому типу пневмококка, которым была вызвана болезнь. Продолжитель-ность иммунитета от 6 месяцев до года.

Пневмококки. Профилактика инфекции

1. Ограничение контакта с больными пневмонией.
2. Выделения изо рта и носа больного должны собираться и подвергаться дезинфекции.
3. После осмотра больного руки персонала следует обработать дезраствором.
4. Больной должен принимать меры к ограничению распростране-ния капель влаги при кашле и разговоре.

Заключение

– Капсула является главным фактором вирулентности пневмо-кокков, поскольку она защищает микроб от фагоцитоза в орга-низме человека, являющегося естественным хозяином этого микроба.

– Пневмококки образуют мало каталазы и пероксидазы, но они хорошо растут на обогащенных средах, продуцируя достаточное количество молочной кислоты. Факультативные анаэробы. В отличие от других стрептококков растворяются в желчи.

– Водорастворимые капсульные полисахариды определяют типоспецифичность пневмококков. По меньшей мере 88 вариантов и субвариантов Streptococcus pneumoniae могут вызвать болезнь. Наиболее вирулентным является вариант 3, имеющий утолщен-ную капсулу и образующий на среде слизистые колонии.

– Пневмококки являются причиной трех основных болезней: пневмония (долевая и бронхопневмония), менингит и воспале-ние среднего уха. Отличительным признаком пневмококкового поражения является образование фибрина в очаге воспаления.

– Пневмонию могут вызвать разные микроорганизмы. Она может наблюдаться в виде вспышек, часто как госпитальная инфекция.

Морфология, культуральные, биохимические свойства. Пневмо­кокки (Streptococcus pneumoniae) имеют вытянутую форму, напоми­нающую пламя свечи или ланцет. Располагаются попарно (диплокок­ки), острыми концами в разные стороны. Каждая пара окружена кап­сулой. Пневмококки не образуют спор и жгутиков. Грамположитель­ны (Рис. 27) * .

На простых питательных средах не растут, на кровяном агаре образуют мелкие колонии с зеленоватой зоной вокруг. В отличие от пиогенных стрептококков расщепляют инулин и растворяются в жел­чи.

Антигены. Пневмококки имеют капсульный антиген, М-белок, расположенный под капсулой, и полисахаридный антиген клеточной стенки. По капсульному антигену пневмококки разделяют на 84 се­ровара.

Факторы патогенности. Пневмококки образуют ферменты, участ­вующие в патогенезе заболеваний: гиалуронидазу, фибринолизин, гемотоксин, лейкоцидин, М-белок участвует в адгезии пневмококков к клеткам, капсула создает устойчивость к фагоцитозу.

Устойчивость. Во внешней среде пневмококки неустойчивы. При 60 о С погибают через 10 минут, чувствительны к дезинфицирующим веществам, но в высушенной мокроте могут сохраняться долго.

Заболевания у человека. Пневмококки вызывают у человека крупозную пневмонию. Они могут также вызвать генерализованные формы инфекции: менингит, сепсис. В то же время пневмококки яв­ляются обитателями слизистой оболочки верхних дыхательных путей здоровых людей и при снижении сопротивляемости организма (зас­тойные явления в легких, снижение их защитной функции) могут вызвать пневмонию. Заболевания возникают и при заражении извне, воздушно-капельным путем. Источником инфекции могут быть больные и носители. Возникновению пневмонии способствует переохлаждение, перенесение гриппа и другие неблагоприятные факторы.

Иммунитет. У многих людей имеется неспецифическая резис-

тентность к пневмококковой инфекции. После перенесенного заболе­вания иммунитет слабый, кратковременный, типоспецифический, Час­то наблюдаются случаи повторной пневмонии вследствие повышенной чувствительности к возбудителю.

Микробиологическая диагностика. Материалом для исследования являются мокрота, кровь, спинномозговая жидкость. Материал надо доставлять в лабораторию немедленно, так как пневмококк быстро погибает. Обнаружение в мазках грамположительных ланцетовидных диплококков, окруженных капсулой, позволяет предположить наличие пневмококков. Чистую культуру можно выделить путем посева на кровяной агар, но при этом помехой могут оказаться посторонние микробы. Эффективным методом является заражение белых мышей внутрибрюшинно, что приводит к развитию у них сепсиса. Из посе­вов крови можно выделить чистую культуру пневмококка.

Профилактика и лечение. Специфическая профилактика не раз­работана. Для предупреждения эндогенной инфекции у пациентов, которые должны подолгу лежать, а также у больных, получающих гормональную или лучевую терапию, проводится иммуностимулирующая терапия.

Для лечения больных пневмонией применяют пенициллин, макро­лидные антибиотики.

Пневмококк является грамположительным, альфа-гемолитическим (в аэробных условиях) или бета-гемолитическим (в анаэробных условиях), анаэробным (организм, для существования которого не нужен кислород) микроорганизмом. Представитель рода Streptococcus.

В 1884 году Э. Френкель и А. Вайчелбаум дали точное описание морфологии и этиологической роли микроба и назвали его возможным этиологическим агентом пневмонии.

Морфологические характеристики

Pneumococcus представляют собой грамположительные глобулярные бактерии размером от 0,5 до 1,5 микрометров. Их клетки расположены в парах, заключенных в общую капсулу. Не образует споры и не имеет полос. В условиях искусственного кормления они образуют капсулу только с добавлением крови или сыворотки.

Культурные особенности

Для их роста микроорганизмы требуют слабощелочного рН 7,2-7,6. На кровяном агаре они образуют небольшие колонии диаметром около 1 мм с плоской периферией, напоминающей капли росы. Другие колонии могут выглядеть блестящими из-за производства капсульных полисахаридов.

Антигенная структура

Основными антигенами являются капсулярные полисахариды. Исходя из этого, пневмококки подразделяются на 84 серотипа.

Факторы патогенности и вирулентности

Пневмококк отделяет белки под названием адгезин, что позволяет им прикрепиться к эпителиальным клеткам, а также имеет пневмолизин, который образует поры в мембранах клеток мерцательного эпителия из верхних дыхательных путей.

Перекись водорода, производимая пневмококком, усиливает разрушение ткани, но ведущим фактором патогенности является капсула, которая защищает бактерии Streptococcus pneumoniae от фагоцитоза. Несвоенные виды не являются патогенными для человека.

Эпидемиология

Пневмококк — это естественный обитатель верхних дыхательных путей у 5-40% людей. Поскольку 40-70% людей в свое время являются носителями вирулентных пневмококков, нормальная слизистая оболочка дыхательных путей обладает большой естественной устойчивостью.

Пациенты, страдающие пневмококковой инфекцией, приобретают краткосрочный иммунитет. Тяжесть заболевания самая высокая среди самых молодых и самых старых слоев населения, а также в менее развитых странах. Взрослые серотипы 1-8 ответственны за около 75% пневмококковой пневмонии и более половины всех случаев смерти от бактериемии. Типы 6, 14, 19 и 23 наиболее распространены у детей.

Патогенез и клиническая картина

Streptococcus pneumoniae является важным возбудителем, вызывающим:

• сепсис;
• менингит;
• пневмония.

Предрасполагающими факторами являются перенапряжение, усталость или нарушение функции очищения эпителиального эпителия верхних дыхательных путей. Инфекция может распространяться через кровь, что может привести к или воспалению других тканей и органов.

Пневмококковая пневмония составляет около 60% всей бактериальной пневмонии. Типичные локализации:

стрептококковая пневмония в горле;
стрептококковая пневмония в носу.

Симптомы пневмококковой болезни зависят от локализации инфекционного процесса. Они могут включать:

• кашель;
• одышка;
• лихорадка;
• боль в груди.

Микробиологическая диагностика

Для микробиологического диагноза необходимо изучить:

• мокрота;
• раневые выделения;
• гной;
• ликвор.

Микроскопические препараты, окрашенные по Граму, получают из изучаемых материалов. Для выделения чистой культуры проводили культуру на кровяном агаре. Наблюдение небольших колоний после 18- го часа культивирования является признаком роста пневмококка.

В случае пневмококкового сепсиса необходимо положить кровь в питательной среде на кровать пациента.

Важная особенность заключается в том, что нежизнеспособные бактерии окрашиваются как грамотрицательные.

Конкретная профилактика

При профилактике пневмококковых инфекций вводится поливалентная вакцина, содержащая полисахаридные антигены 23 серотипов. Вакцинаты приобретают длительный иммунитет. Таким образом, пневмококковая болезнь предотвращается путем искоренения колонии носоглотки.

Лечение

Пневмококки плохо устойчивы и легко погибают даже при комнатной температуре, чувствительные к желчным солям. Дезинфицирующие растворы убивают их примерно на 2 минуты.

Пенициллин G и хлорамфеникол используются часто. Лечение пневмококковых инфекций осложняется появлением резистентных к пенициллину и других штаммов антибиотиков. В Соединенных Штатах 15% пневмококков устойчивы к пенициллину. Увеличение использования ванкомицина для инвазивных инфекций S. pneumoniae может способствовать развитию резистентности или толерантности к этому препарату.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ

ПНЕВМОКОККИ

КАЗАНЬ 1999

УДК 576.851.21(07)

Печатается по решению Центрального координационно-методического совета Казанского государственного медицинского университета.

Составители:

(Заведующий кафедрой микробиологии д.м.н., профессор О.К.Поздеев, ассистент кафедры микробиологии к.м.н., Е.Р.Федорова.

Рецензенты:

заведующий кафедрой эпидемиологии Казанского государственного медицинского университета, д.м.н., доцент М.Ш. Шафеев, заведующий кафедрой эпидемиологии Казанской государственной медицинской академии, д.м.н., профессор В.Е. Григорьев.

Пневмококки /O.K. Поздеев, Е.Р. Федорова -Казань: КГМУ,1999. - 14 с.

Копируя, распространяя, публикуя текст либо его часть на своих ресурсах, Вы принимаете на себя ответственность согласно действующему законодательству.

Исключительно для использования произведения в личных целях (ст.18, ст.26 Закона РФ «Об авторском праве и смежных правах»). Коммерческое воспроизведение запрещено.

Казанский государственный медицинский университет, 1999

Пневмококк (Streptococcus pneumoniae) впервые выделил Пастер (1881) во время работы над антирабической вакциной и первоначально посчитал его возбудителем бешенства. Этиологическую роль микроорганизма в развитии пневмоний у человека доказали Френкель и Вайхзельбаум (1884). Бактерии колонизируют организмы человека и животных и входят в группу так называемых «оральных» стрептококков. Являются основными возбудителями воспаления лёгких, также могут вызвать плевриты, менингиты, ползучие язвы роговицы, гнойные воспаления среднего уха, септические состояния и другие заболевания. В IX издании определителя бактерий Берджи (1994 год) пневмококки включены в 17 группу «Грамположительные кокки».

Эпидемиология поражений. Пневмококк - один из основных возбудителей бактериальных пневмоний, регистрируемых вне стационаров (2-4 случая на 1000 человек); ежегодно в мире наблюдают не менее 500000 случаев пневмококковых пневмоний (реальная величина значительно больше). Наиболее подвержены инфекции дети и лица преклонного возраста. Резервуар инфекции - больные и носители (20-50% детей дошкольного возраста и 20-25% взрослых лиц); основной путь передачи - контактный; в период вспышек также воздушно-капельный. Пик заболеваемости приходится на холодное время года. В подавляющем большинстве случаев клинические формы инфекции развиваются при нарушениях резистентности организма (в том числе вследствие холодовых стрессов), а также на фоне иной патологии (серповидноклеточной анемии, болезни Ходжкина. ВИЧ-инфекции, миеломы, сахарного диабета, состояний после спленэктомии и др.) или при алкоголизме. Наибольшее эпидемиологическое значение в патологии у взрослых играют варианты 1, 2 и 3; у детей - 1, 2, 3 и 14 варианты. Вирулентность сероваров в нисходящем порядке - 3, 1, 2, 5, 7 и 8 варианты. К пневмококкам чувствительны белые мыши (при заражении они погибают от септицемии в течение суток), телята, ягнята, поросята, собаки и обезьяны.

Морфология. Пневмококки неподвижны, они не образуют спор, имеют слегка вытянутую форму, напоминающую контуры пламени свечи. В мазках из клинического материала располагаются парами, каждая из которых окружена толстой капсулой. В мазках с питательных сред могут располагаться короткими цепочками и быть более округлыми. На простых средах образуют тонкую капсулу; её развитие стимулирует внесение крови, сыворотки или асцитической жидкости. Капсулообразование наиболее хорошо выражено у бактерий III типа. При расположении цепочками капсула может быть общей.

Культуральные свойства. Пневмококки аэробы или факультативные анаэробы; при культивировании предпочтительны капнофильные условия (5-10% СО2). Хемоорганогрофы и хорошо растут на кровяных или сывороточных средах, дополненных внесением 0,1% глюкозы. Могут расти в диапазоне температур 28-42 °С, оптимум - 37 °С. Оптимум рН -7,6-7,8. На плотных средах образуют нежные полупрозрачные четко-очерченные-колонии диаметром около 1мм. Иногда они могут быть плоскими с центральным углублением; подобно прочим стрептококкам, колонии никогда не сливаются

между собой. На кровяном агаре образуют мелкие полупрозрачные колонии зеленовато-серого цвета. Центр колоний более темный, периферия светлее. Под колонией и по ее периферии видна зона а-гемолиза в виде зеленоватой обесцвеченной зоны (что обусловлено переходом гемоглобина в метгемоглобин). Колонии пневмококка III типа часто имеют слизистую консистенцию, величина их до 2 мм. Они мутноваты, могу г сливаться между собой. Образуют S- и R-формы колоний. При переходе из S- в R-форму теряют способность синтезировать капсулу. На жидких средах с сывороткой и 0,2% глюкозой дают равномерное помутнение и небольшой хлопьевидный осадок. При длительном культивировании осадок увеличивается.

Устойчивость. Пневмококки относят к группе нестойких микроорганизмов. В сухой мокроте они сохраняются до двух месяцев. Способны длительно сохраняться при низких температурах; при температуре 60 °С погибают в течение 3-5 минут. 3% раствор карболовой кислоты убивает их за 1-2 минуты. На пневмококки губительно действуют оптохин (в концентрации 1:100000) и желчь, что используют для идентификации бактерий.

Пневмококки отличаются от других микроорганизмов по ряду свойств (табл.1).

Таблица 1 Биохимические свойства пневмококков

Тест-субстрат	Результат	Тест-субстрат	Результат
Рост при 100° С
		Раффиноза
Среда с 6,5% Nad
а-гемолиз
В-гемолиз		Трегалоза
		Фосфатаза
Гиппурат		в-галактозидаза
Глицерин
Обозначения: «+» - 90% или более штаммов положительные; (+) - 80-89% штаммов положительные; d - 21-79% штаммов положительные; (-) - 11-20% штаммов положительные; «- - 90% или более штаммов отрицательные.

Антигенная структура. У пневмококков обнаружены несколько видов антигенов полисахаридный, 0-соматический антиген, находящийся в клеточной стенке; полисахаридные капсульные К-антигены и М-белок. Полисахаридный соматический антиген аналогичен С-субстанции других стрептококков. Родство обуславливает сходство химической структуры рибиттейхоевых кислот, связанных с холинфосфатом. Капсульные антигены также имеют полисахаридную природу, состоят из повторяющихся в различном сочетании моносахаров: D-глюкозы, D-галактозы и L-рамнозы. По структуре капсульных антигенов пневмококки разделяют на 84 серовара. Следует помнить, что капсульные антигены перекрёстно реагируют с антисыворотками к антигенам стрептококков групп А и В, а также с сыворотками к антигенам клебсиелл и эшерихии. При переходе из S в R-форму капсульные антигены утрачиваются. Для серотипирования пневмококков выпускают групповые сыворотки, обозначаемые латинскими буквами (А, В, С, D и т.д.) и серовариантные, обозначаемые римскими цифрами. Агглютинирующую сыворотку III не включают в смеси сывороток. Её выпускают отдельно и её нельзя разводить. У человека наиболее часто выделяют пневмококки I, II и III серовариантов. Они наиболее вирулентны для человека, поэтому реакцию агглютинации первоначально ставят, используя антисыворотки к этим вариантам. При отрицательном результате реакцию агглютинации ставят со смесью сывороток А, В, С и т.д. (до получения положительного результата), а затем с отдельными антисыворотками. Для более быстрой идентификации сероваров применяют реакцию Нойфельда (иммунного набухания капсулы). Метод основан на способности капсул пневмококков увеличиваться в объёме в присутствии гомологичной антисыворотки, что регистрируют светооптической микроскопией. Капсульные полисахариды обладают сенсибилизирующими свойствами, проявляющимися в развитии реакции гиперчувствительности замедленного типа, выявляемой с помощью кожных проб.

Факторы патогенности. Основным фактором является капсула, защищающая бактерии от микробицидного потенциала фагоцитов и уводящая их от действия опсонинов. Некапсулированные штаммы практически авирулентны и встречаются редко. Большую часть пула противопневмококковых AT составляют AT к Аг капсулы. Важной функцией капсулы и М-белка также является обеспечение адгезии на слизистой. Существенное значение имеет субстанция-С, специфически взаимодействующая с С-реактивным белком. Следствием подобного реагирования являются активация комплементарного каскада и высвобождение медиаторов острой фазы воспаления; их аккумуляция в лёгочной ткани стимулирует миграцию полиморфноядерных фагоцитов. Формирование мощных воспалительных инфильтратов сопровождается нарушением гомеостаза лёгочной ткани и её опеченением. Пневмококки образуют эндотоксин, а- и в-гемолизины (пневмолизины), лейкоцидин. а-пневмолизин является термолабильным белком, способным нейтрализовать 0-стрептолизин,

эритрогенное вещество, нейраминидазу. Пневмококки также синтезируют ряд ферментов, вносящих вклад в патогенез поражений - мурамидазу, гиалуронидазу (способствует распространению микроорганизмов в тканях), пептидазу (расщепляет IgA).

Патогенез поражений. Биотопом пневмококков являются верхние дыхательные пути. Патогенез большинства пневмоний включает аспирацию слюны, содержащей S. pneumoniae, и проникновение бактерий в нижние отделы воздухоносных путей. Существенное значение имеет нарушение защитных дренирующих механизмов - кашлевого толчка и мукоцилиарного клиренса. У взрослых чаще наблюдают долевые поражения лёгких, у детей и лиц преклонного возраста доминируют перибронхиальные или очаговые поражения. Формирование мощных воспалительных инфильтратов сопровождается нарушением гомеостаза лёгочной ткани и её опеченением. Инфекции наиболее вирулентным 3 сероваром могут сопровождаться образованием полостей в паренхиме лёгких. Из первичного очага возбудитель может проникать в плевральную полость и перикард либо гематогенно диссеминировать и вызвать менингиты, эндокардиты и суставные поражения

Клинические проявления. Классическая пневмококковая пневмония начинается внезапно; отмечают подъём температуры тела, продуктивный кашель и боли в груди. У ослабленных лиц и пожилых заболевание развивается медленно, с незначительной лихорадкой, нарушением сознания и признаками лёгочно-сердечной недостаточности. Стрептококковые менингиты регистрируют во всех возрастных группах; они характеризуются бурным началом с подъёмом температуры тела, ригидностью шейных мышц, головной болью, тошнотой и рвотой. Поражения сосудов мозговых оболочек часто сопровождаются потерей сознания; среди детей и в преклонном возрасте летальность может достигать 80%. Довольно часто у лиц с иммунодефицитами (например, ВИЧ-инфицированных) или пациентов со спленэктомией отмечают гематогенные пневмококковые поражения, а также синуситы, мастоидиты, средние отиты, эндокардиты и перитониты. После перенесенного заболевания развивается нестойкий иммунитет, носящий типоспецифический характер и обусловленный появлением антител против типового капсульного полисахарида.

Лечение. Основу терапии пневмококковой инфекции составляют антибиотики - пенициллин, тетрациклин, левомицетин, ванкомицин, рифампицин, цефтриаксон.

Профилактика. Неспецифическая профилактика пневмококковых инфекций направлена на выявление больных и носителей с последующим их лечением. Для специфической профилактики инфекции детям старше двух лет, взрослым, входящим в группы риска, а также здоровым лицам в период вспышки заболевания проводят прививки поливалентной полисахаридной вакциной «Пневмовекс 23». Препарат содержит 23 капсульных полисахаридных антигенов пневмококков (1, 2, 3, 4, 5, 6В 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11А, 12F, 14, 15В, 17F, 18С, 1-9F, 19А, 20, 22F, 23F, 33F). Антигены

пневмококков получены из 90% штаммов, выделенных из крови больных инвазионной пневмококковой инфекции в США и соответствующих штаммам, встречавшимся в России. Иммунизация проводится двукратно с интервалом 5-8 лет.

После вакцинации создается искусственный, активный, типоспецифический иммунитет.

Лабораторная диагностика. «Золотым стандартом» является выделение возбудителя. Следует помнить, что материал необходимо исследовать быстро, т.к. бактерии склонны к быстрому аутолизу, обусловленному активностью внутриклеточных ферментов. Материалом для исследования является мокрота, плевральный выпот и прочие экссудаты, спинномозговая жидкость, кровь, слизь из носа и зева, отделяемое глазных изъязвлений, выделения из уха, моча, кусочки органов (в случае смерти больного). Сигнальный ответ на пневмококковую инфекцию может быть выдан при обнаружении в мазках из мокроты нейтрофилов и грамположительных ланцетовидных диплококков (не менее 10 в поле зрения). В противном случае прибегают к выделению возбудителя.

Первый этап исследования. Патологический материал подвергают предварительной бактериоскопии (кроме крови). Мокроту помещают в стерильную чашку Петри, отмывают, петлей захватывают гнойно-слизистый комочек, растирают на предметном стекле, высушивают и красят по Граму. В мазке обнаруживают грамположительные ланцетовидной или овальной формы кокки, окруженные капсулой (капсулообразование наблюдается только у пневмококков, выделенных от больных и зараженных животных). Выявление капсул пневмококков можно проводить по методу Бурри-Гинса. Посев патологического материала производят на 5-10% кровяной или сывороточный агар и на среду обогащения (8-10% сывороточный бульон). При подозрении на сепсис пневмококковой природы 5-10 мл крови больного засевают на 45-90 мл сывороточного бульона. Спинно-мозговую жидкость, если она прозрачна, центрифугируют и несколько капель из осадка засевают на питательные среды. В качестве среды обогащения используют полужидкий сывороточный агар. Посевы инкубируют при 37 °С 24 часа. Лучшим методом выделения чистой культуры пневмококков является заражение белых мышей патологическим материалом. Мокроту, отмытую в чашке Петри стерильным физиологическим раствором, растирают в стерильной ступке стерильным пестиком или битым стеклом при добавлении физиологического раствора в отношении 1:2-1:5. Взвесь отстаивают, надосадочную жидкость в количестве 0,5-1 мл вводят белым мышам внутрибрюшинно. При наличии в материале пневмококков мыши погибают в течение 72 часов. В мазках из органов и крови обнаруживают типичные пневмококки. Также производят посев органов и крови на сывороточный бульон и на чашки Петри с кровяным или сывороточным агаром.

Второй этап исследования. Изучают характер роста на питательных средах. На кровяном агаре колонии пневмококков мелкие, круглые, с ровными

краями, нежные, окруженные зоной позеленения среды (что весьма напоминает рост зеленящих стрептококков). На сывороточном агаре колонии нежные, полупрозрачные и прозрачные. При бактериоскопии мазков, окрашенных по Граму. обнаруживают грамположительные диплококки без капсул. После бактериоскопии колонии, подозрительные на пневмококки пересеивают на скошенный сывороточный или кровяной агар или на сывороточный бульон. При микроскопии мазков со среды обогащения наряду с различной микрофлорой можно обнаружить грамположительные кокки, располагающиеся парами или короткими цепочками. Материал со среды обогащения пересеивают на плотные питательные среды. Посевы инкубируют при 37°С 24 часа.

Третий этап исследования. Па скошенном кровяном агаре пневмококки образуют нежный тонкий полупрозрачный налёт. На сывороточном бульоне пневмококки вызывают помутнение и легкий осадок. В мазках с плотных питательных сред пневмококки могут иметь различный вид. Наряду с диплококками удлиненной формы с заостренными наружными концами, напоминающими пламя свечи, встречают клетки правильной овальной и круглой формы. В бульонной культуре пневмококки часто располагаются цепочками. Па основании морфологических и культуральных свойств пневмококки трудно отличить от зеленящих стрептококков, поэтому для их дифференцировки предложен набор специальных тестов:

Растворимость в желчи (дезоксихолатная проба);

Способность разлагать инулин;

Чувствительность к оптохину;

Реакция агглютинации со специфическими антипневмококковыми сыворотками;

Способность разлагать глюкозу, мальтозу, сахарозу, лактозу, маннит, сорбит и салицин.

Наиболее доступными методами, дифференцирующими пневмококки от прочих стрептококков являются проба с оптохином (угнетает их рост); от зеленящих стрептококков их отличает способность ферментировать инулин, а также чувствительность к желчи.

Дезоксихолатная проба. После предварительной бактериоскопии в пробирку с 5 каплями стерильной бычьей желчи вносят 10 капель, выделенной чистой культуры (лучше бульонной). Контролем служит культура, внесённая в пробирку с 5 каплями физиологического раствора. Через 30-60 минут инкубации при 37 °С наблюдают полный лизис культуры в виде просветления в пробирке с желчью, в контрольной пробирке смесь остаётся мутной. Следует помнить, что авирулентные культуры пневмококка устойчивы к желчи.

Устойчивость к желчи также можно проверять посевом в 10% желчный бульон. В среду вносят исследуемый материал, при этом бульон мутнеет. После 24 часовой инкубации при 37 °С на наличие пневмококков укажет просветление бульона в результате лизиса бактерий.

Также можно использовать диски, пропитанные 20% раствором желчи. Диски помешают на выросшую культуру в чашке и инкубируют 1-2 часа при 37 °С. При наличии пневмококков колонии лизируются вокруг диска на расстоянии 1 -2 мм.

Проба на инулин. Культуру пневмококка засевают на среду с инулином. Для этого к 100 мл прогретой при 56 °С в течение 30 мин бычьей сыворотки прибавляют 200 мл стерильной дистиллированной воды, 18 мл лакмусовой настойки и 3 г инулина, стерилизуют текучим паром 30 минут. Посевы инкубируют при 37 °С 24 часа. Пневмококк разлагает инулин, в результате чего среда краснеет. Зеленящий стрептококк не вызывает покраснения среды.

Проба с оптохином. Испытуемую культуру пневмококка засевают на сывороточный бульон с оптохином в разведении 1:100000 или 1:200000. Пневмококк на такой среде не растёт. Также можно определить чувствительность к оптохину и посевом на 10% кровяной агар, содержащий оптохин в разведении 1:50000. Контролем является посев культуры на кровяной агар. Пневмококки не растут на среде с оптохином, на контрольной среде наблюдается рост пневмококков. Можно использовать диски, пропитанные 6 мкг оптохина, которые накладывают после посева на поверхность среды. У пневмококков вокруг диска образуется зона задержки роста не менее 18 мм диаметром.

Проба на вирулентность. Суточную культуру пневмококка, выращенную на сывороточном бульоне разводят 1% стерильной пептонной водой (рН - 7,6) или слабощелочным бульоном до 1:10. Разведённую культуру вводят внутрибрюшинно белым мышам весом 16-20 гр в объёме 0,5 мл и наблюдают в течение 72 часов. Из органов погибшей мыши делают высевы на питательные среды и микроскопируют мазки-отпечатки. К высоковирулентным культурам относят пневмококки, вызывающие гибель мышей после введения культуры в разведении 1:10. Авирулентные культуры не вызывают гибели мышей.

Серотипирование пневмококков. 18-часовую культуру проверяют в реакции микроагглютинации по Сэбину. На предметное стекло наносят 4 капли культуры пневмококка. К 1 капле добавляют каплю антипневмококковой сыворотки типа 1, ко 2-й - сыворотку типа II, к 3-й - сыворотку - 111, к 4-й - каплю нормальной сыворотки. Смеси на стекле перемешивают петлей и рассматривают под лупой или под микроскопом при малом увеличении. В положительном случае в одной из первых трех капель наблюдается агглютинация. Тип пневмококка определяют в реакции агглютинации со специфическими агглютинирующими сыворотками первых трёх фиксированных типов. Культуры, которые не агглютинируются указанными типами сывороток, относят к Х-группе. Реакцию ставят следующим образом. Разливают 18 - часовую бульонную культуру по 0,5 мл в пробирки. Затем вносят в равном объёме сыворотки, разведённые физиологическим раствором в соотношении 1:5. Контролями служат 2 пробирки, одна из которых содержит испытуемую культуру в смеси с

нормальной кроличьей сывороткой, а другая - только исследуемую культуру. Содержимое пробирок тщательно встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 37 °С, после чего проводят предварительный учет реакции. Окончательные результаты отмечают после дополнительного выдерживания при комнатной температуре в течение 20 часов. Агглютинацию оценивают на четыре плюса, если содержимое пробирок полностью просветляется, а агглютинационная культура представляет собой плотную пленку, не разбивающуюся при встряхивании; на три плюса если при полном просветлении содержимого пробирки агглютинирующая культура легко разбивается на части; на два плюса - если просветления не наступает, в мутном содержимом пробирки хорошо видны невооруженным глазом частицы агглютинированной культуры; при агглютинации на один плюс в пробирке обнаруживают мелкозернистую смесь склеенных пневмококков. При отрицательной реакции, видимой глазом, агглютинации не наблюдают;

содержимое пробирок после встряхивания представляет собой равномерную муть.

Типирование пневмококков Х-группы проводят с помощью групповых

сывороток, содержащих смесь типовых агглютинирующих сывороток, взятых

в равных объёмах. Готовят следующие групповые сыворотки путем

смешивания равных объемов неразведенных типовых диагностических

сывороток (Lund, I960):

А -1, II, IV, V, XVIII серовары;

В - VI, VIII, XIX серовары;

С - VII, XX. XXIV, XXXI, XL серовары;

D - IX, XI, XVI, XXXVI. XXXVII серовары;

Е - X, XXI. XXXIII, XXXIX серовары;

F - XII. XVII. XXII, XXXVII, XXXII, XLI серовары;

G - XIII, XXV. XXIX, XXXIV, XXXV, XXXVIII, XLII, XLVII серовары;

J - XLIII. XLIV, XLV, XLVI серовары.

Агглютинирующую сыворотку III типа используют per se (без смешивания с другими типовыми сыворотками) из-за трудности ее получения в достаточно высоком титре. Типирование проводят в два приёма: сначала с помощью групповых сывороток, а затем с индивидуальными сыворотками той группы, с которой была получена положительная реакция. Серотипирование пневмококков применяют преимущественно для эпидемиологических исследований результатов специфической серотерапии и серопрофилактики.

Микроагглютинацию пневмококков по методу Сэбина можно получить при смешивании антипневмококковых сывороток с экссудатом из брюшной полости мыши, зараженной мокротой больного. Уже через четыре часа после заражения в экссудате обнаруживают чистую культуру пневмококков, дающую положительную агглютинацию по Сэбину.

Ускоренные методы обнаружения и типирования пневмококков. 1. Метод Нойфельда или феномен набухания капсулы пневмококка. По одному комочку свежевыделенной мокроты больного наносят на три

покровных стекла, к каждому из них прибавляют каплю неразведенной специфической антипневмококковой сыворотки (1, II, III типов) и каплю синьки Лёффлера. Капли тщательно смешивают, покрывают предметным стеклом с лункой, смазанной по краям вазелином. Через две минуты рассматривают висячие капли под микроскопом с иммерсионной системой. При положительном случае видно резкое увеличение капсул пневмококков. При отрицательном результате капсулы едва заветны. Реакция набухания специфична и не даёт положительного результата с другими капсульными бактериями. Её не применяю г для исследования мокроты от больных, леченных сульфаниламидами и антибиотиками, т.к. в этом случае могут выделяться безкапсульные пневмококки.

2. Метод преципитации. 5-10 мл мокроты кипятят в водяной бане до получения плотного сгустка. Сгусток растирают и добавляют небольшое количество физиологического раствора, вновь кипятят несколько минут для извлечения специфического полисахарида из пневмококков. Взвесь центрифугируют, с полученной прозрачной жидкостью и специфическими типовыми сыворотками в преципитационных пробирках ставят реакцию кольцепреципитации. Появление кольца на границе соприкосновения жидкостей указывает на положительный результат.

3. Определение капсул пневмококков по Бурри. На конец предметного стекла наносят каплю исследуемого материала и каплю туши. Смесь перемешивают и делают мазок, высушивают на воздухе и, не фиксируя, микроскопируют. Фон препарата - тёмно-дымчатый, микробные тела и их капсулы не окрашиваются. Препарат, изготовленный по Бурри, можно зафиксировать смесью Никифорова, промыть водой, окрасить фуксином Циля, разведенным 1:3 в течение 3-5 минут. На тёмном фоне мазка выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии ярко малинового цвета (метод Гинса).