Применение фагов в медицине и микробиологии. Практическое применение бактериофагов
Препараты фагов применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике - для определения фагочувствительности и фаготипироваиия при идентификации микроорганизмов. Действие фагов основано на их строгой специфичности. Лечебно-профилактическое действие фагов обусловливается литической активностью самого фага, а также иммунизирующим свойством находящихся в фаголизатах компонентов (антигенов) разрушенных микробных клеток, особенно в случае неоднократного применения. При получении препаратов фагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответственно типичные культуры микроорганизмов. Бактериальную культуру в жидкой питательной среде, находящуюся в логарифмической фазе размножения, заражают маточной взвесью фага.
Лизированную фагом культуру (обычно на следующий день) фильтруют через бактериальные фильтры и к фильтрату, содержащему фаг, в качестве консерванта добавляют раствор хинозола.
Готовый препарат фага представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета. Для более длительного хранения некоторые фаги выпускаются в сухом виде (в таблетках). При лечении и профилактике кишечных инфекций фаги применяют одновременно с раствором гидрокарбоната натрия, так как кислое содержимое желудка разрушает фаг. Сохраняется фаг в организме недолго (5-7 дней), поэтому рекомендуется применять повторно.
В Советском Союзе выпускались следующие препараты, используемые для лечения и профилактики заболеваний: брюшнотифозный, сальмопеллезный, дизентерийиныи, колифаг, стафилококковый фаг и стрептококковый. В настоящее время фаги применяют для лечения и профилактики в сочетании с антибиотиками. Такое применение оказывает более эффективное действие на антибиотикоустойчивые формы бактерий.
Диагностические бактериофаги широко применяются для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время разработаны фагодиагностика и фаготипирование бактерий рода Salmonella, Vibrio и стафилококков. Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических.
В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.
Набирает все больше поклонников среди врачей, отодвигая антибиотики на второй план. Когда-то появление антибиотиков полностью изменило представление врачей о лечении. Ранее безнадежные пациенты стали поправляться, предельно упростились алгоритмы лечения, резко упала смертность… Чудеса! Волшебные лекарства! Но восторженное отношение продержалось недолго. Слишком много проблем стало возникать.
Враг моего врага – мой друг
Сейчас «скользкие» вопросы антибиотикотерапии известны всем. Действие антибиотиков сопровождается:
Уничтожением необходимой, «полезной», микрофлоры кишечника и слизистых;
Активным ростом новых штаммов бактерий, устойчивых к ним;
Возникновением побочных эффектов за счет системного действия препаратов.
В связи с этим актуальным стал поиск принципиально иных лекарств для лечения бактериальных инфекций. И тут на первый план вышли бактериофаги.
Бактериофаги – это вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Вирус закрепляется на клеточной стенке бактерии и вводит внутрь клетки свой генетический материал. В результате начинается синтез новых вирусов, а затем происходят лизис бактериальной клетки и высвобождение 200-1000 новых фагов, которые инфицируют другие бактерии. Когда все бактерии патогенного штамма уничтожены, бактериофаги бесследно выводятся из организма. Многие бактериофаги узкоспецифичны, и каждый штамм вируса поражает только определенный вид бактерий, никак не влияя на прочие микроорганизмы и клетки организма. Это обеспечивает значительное уменьшение числа побочных эффектов.
Таким образом, к несомненным плюсам использования бактериофагов можно отнести:
Высокий профиль безопасности, позволяющий использовать их у пациентов любого возраста, начиная с новорожденных и заканчивая глубокими стариками;
Уменьшение риска возникновения устойчивых штаммов бактерий;
Возможность их сочетания с любыми другими препаратами, в том числе и антибиотиками.
Пожалуй, единственное, что ограничивает использование бактериофагов, – это их избирательность, из-за которой перед лечением необходимо уточнить природу возбудителя и его чувствительность к различным видам бактериофагов. Подобный анализ проводится отнюдь не везде и занимает определенное время, но усовершенствование диагностических систем позволяет надеяться, что эта проблема в скором времени может быть разрешена.
От теории – к практике
Существуют разные виды бактериофагов: монофаги, направленные на уничтожение только одного вида бактерий, и полифаги, действующие сразу на несколько видов патогенных бактерий. Поскольку бактериофаги чрезвычайно востребованы практически во всех областях медицины, от хирургии и гинекологии до неонатологии и ЛОР-практики, то предусмотрен выпуск бактериофагов в различных формах. Их используют для приема внутрь рег оs, в виде клизм, аппликаций, орошений, для введения в полости ран, влагалища, матки, носа, пазух носа, а также для введения в дренированные полости – брюшную, плевральную, мочевого пузыря, почечной лоханки. Продолжительность курса зависит от клинических показаний и может составить 7-20 дней. Безопасные, эффективные и надежные бактериофаги – это именно то оружие, которое так необходимо в борьбе с патогенными бактериями.
Не только лекарство
Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологиях позволил использовать бактериофаги не только для лечения, но и для других целей. В США, например, бактериофаги применяют в качестве безопасного консерванта для пищевых продуктов. Добавленные к продуктам, бактериофаги препятствуют размножению нежелательных бактерий.
Интересные факты
Открытие бактериофагов произошло в 1894 году, когда британский бактериолог Эрнест Ханкин заметил, что индийских рек Ганг и Джамна обладает значительной антибактериальной активностью, которая полностью исчезает после кипячения. Он предположил, что в воде присутствует некая субстанция, убивающая бактерии. Название «бактериофаг» («поедатель бактерий») эти вирусы получили в 1917 году от французского ученого Феликса Д’ Эрелля, открывшего «невидимого микроба, поражающего дизентерийную палочку». Уточнение природы этого «невидимки» стало возможным только после появления электронной микроскопии.
|
Валентин Викторович Власов — академик РАН, доктор химических наук, профессор, директор Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Лауреат Государственной премии РФ (1999). Автор и соавтор более 300 научных работ и 20 патентов. |
|
Вера Витальевна Морозова — кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор более 30 научных работ и 6 патентов. |
|
Игорь Викторович Бабкин — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор и соавтор 58 научных работ и 2 патентов. |
|
Нина Викторовна Тикунова — доктор биологических наук, заведующая лабораторией молекулярной микробиологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор и соавтор 120 научных работ и 21 патента. |
В середине прошлого века биологическая наука сделала революционный шаг вперед, установив молекулярные основы функционирования живых систем. Огромную роль в успешных исследованиях, которые привели к определению химической природы наследственных молекул, расшифровке генетического кода и созданию технологий манипуляций генами, сыграли бактериофаги, открытые еще в начале прошлого столетия. На сегодняшний день эти бактериальные вирусы освоили много полезных для человека «профессий»: их используют не только как безопасные антибактериальные препараты, но и как дезинфектанты и даже в качестве основы для создания электронных наноустройств.
Когда в 1930-х гг. группа ученых занялась проблемами функционирования живых систем, то в поиске простейших моделей они обратили внимание на бактериофаги - вирусы бактерий. Ведь среди биологических объектов нет ничего проще, чем бактериофаги, к тому же их можно легко и быстро выращивать и анализировать, а вирусные генетические программы невелики.
Фаг - это минимального размера природная структура , содержащая плотно упакованную генетическую программу (ДНК или РНК), в которой нет ничего лишнего. Эта программа заключена в белковую оболочку, снабженную минимальным набором устройств для ее доставки внутрь бактериальной клетки. Бактериофаги не могут размножаться сами по себе, и в этом смысле их нельзя считать полноценными живыми объектами. Их гены начинают работать только в бактерии, используя имеющиеся в бактериальной клетке биосинтетические системы и запасы молекул, необходимых для синтеза. Однако генетические программы этих вирусов принципиально не отличаются от программ более сложных организмов, поэтому эксперименты с бактериофагами позволили установить основополагающие принципы устройства и работы генома.
В дальнейшем эти знания и разработанные в ходе исследований методы стали фундаментом для развития биологической и медицинской науки, а также широкого спектра биотехнологических приложений.
Борцы с патогенами
Первые попытки использовать бактериофаги для лечения инфекционных заболеваний были предприняты практически сразу после их открытия, однако недостаток знаний и несовершенные биотехнологии того времени не позволили достичь полного успеха. Тем не менее дальнейшая клиническая практика показала принципиальную возможность успешного применения бактериофагов при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, мочеполовой системы, при острых гнойно-септических состояниях больных, для лечения хирургических инфекций и т. д.
По сравнению с антибиотиками бактериофаги имеют ряд преимуществ : они не вызывают побочных эффектов, к тому же строго специфичны для определенных видов бактерий, поэтому при их использовании не нарушается нормальный микробиом человека. Однако такая высокая избирательность создает и проблемы: чтобы успешно лечить пациента, нужно точно знать инфекционный агент и подбирать бактериофаг индивидуально.
Фаги можно использовать и профилактически. Так, Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского разработал профилактический продукт «ФУДФАГ» на основе коктейля из бактериофагов, снижающий риск заражения острыми кишечными инфекциями. Клинические исследования показали, что недельный прием препарата позволяет избавиться от гемолизирующей кишечной палочки и других патогенных и условно-патогенных бактерий, вызывающих дисбактериоз кишечника.
Бактериофагами лечат инфекционные болезни не только людей, но и домашних и сельскохозяйственных животных: мастит у коров, колибактериоз и эшерихиоз у телят и свиней, сальмонеллез у кур... Особенно удобно применять фаговые препараты в случае аквакультуры - для лечения промышленно выращиваемых рыб и креветок, так как в воде они долго сохраняются. Бактериофаги помогают защитить и растения , хотя применение фаговых технологий в этом случае затруднено из-за воздействия природных факторов, таких как солнечный свет и дождь, губительных для вирусов.
Фаги могут сыграть большую роль в поддержании микробиологической безопасности продуктов питания, так как применение антибиотиков и химических агентов в пищевой отрасли не решает эту проблему, одновременно снижая уровень экологической чистоты продукции. О серьезности самой проблемы говорят статистические данные: например, в США и России ежегодно регистрируется до 40 тыс. заболевших сальмонеллезом, из которых 1% умирает. Распространение этой инфекции в значительной степени связано с выращиванием, переработкой и потреблением различных видов птицы, и попытки применить для борьбы с ней бактериофаги дали многообещающие результаты.
Так, американская компания Intralytix производит фаговые препараты для борьбы с листериозом, сальмонеллезом и бактериальным загрязнением кишечной палочкой. Они разрешены к применению как добавки, предотвращающие размножение бактерий на продуктах питания - их распыляют на продукты из мяса и домашней птицы, а также на овощи и фрукты. Эксперименты показали, что коктейль из бактериофагов может быть успешно применен и при транспортировке и реализации живой прудовой рыбы для снижения бактериального загрязнения не только воды, но и самой рыбы.
Очевидным применением бактериофагов является дезинфекция , то есть уничтожение бактерий в тех местах, где их не должно быть: в больницах, на пищевых производствах и т. п. Для этой цели британская компания Fixed-Phage разработала метод фиксации фаговых препаратов на поверхностях, обеспечивающий сохранение биологической активности фагов до трех лет.
Бактериофаги - «дрозофилы» молекулярной биологии
В 1946 г. на 11-м симпозиуме в знаменитой американской лаборатории в Колд Спринг Харборе, была провозглашена теория «один ген - один фермент». Бактериолог А. Херши и «бывший» физик, молекулярный биолог М. Дельбрюк доложили об обмене генетическими признаками между различными фагами при одновременном заражении ими клеток кишечной палочки. Это открытие, сделанное в то время, когда физический носитель гена еще не был известен, свидетельствовало, что явление «рекомбинации» - перемешивания генетических признаков, свойственно не только высшим организмам, но и вирусам. Обнаружение этого феномена в дальнейшем дало возможность детально исследовать молекулярные механизмы репликации. Позднее эксперименты с бактериофагами позволили установить принципы устройства и работы генетических программ.
В 1952 г. А. Херши и М. Чейз экспериментально доказали, что наследственная информация бактериофага Т2 закодирована не в белках, как считали многие ученые, а в молекулах ДНК (Hershey & Chase, 1952). Исследователи проследили за процессом воспроизводства в двух группах бактериофагов, одна из которых несла меченные радиоактивной меткой белки, а другая - молекулы ДНК. После инфицирования бактерий такими фагами оказалось, что в зараженную клетку передается только вирусная ДНК, что и послужило доказательством ее роли в хранении и передаче наследственной информации.
В том же году американские генетики Д. Ледерберг и Н. Циндлер в эксперименте с участием двух штаммов сальмонелл и бактериофага Р22 установили, что бактериофаг способен в процессе размножения включать в себя фрагменты ДНК бактерии-хозяина и передавать их другим бактериям при заражении (Zinder & Lederberg, 1952). Это явление переноса генов от бактерии-донора к реципиенту было названо «трансдукцией». Результаты эксперимента стали очередным подтверждением роли ДНК в передаче наследственной информации.
В 1969 г. А. Херши, М. Дельбрюк и их коллега С. Луриа стали Нобелевскими лауреатами «за открытия, касающиеся механизма репликации и генетической структуры вирусов».
В 1972 г. Р. Берд с коллегами при изучении процесса репликации (копировании клеточной информации) ДНК кишечной палочки использовали бактериофаги в качестве зондов, способных встраиваться в геном бактериальной клетки, и обнаружили, что процесс репликации идет в двух направлениях вдоль хромосомы (Стент, 1974).
Семь дней творения
Современные методы синтетической биологии позволяют не только вносить различные модификации в фаговые геномы, но и создавать полностью искусственные активные фаги. Технологически это несложно, нужно только синтезировать фаговый геном и ввести его в бактериальную клетку, а там он уже сам запустит все процессы, необходимые для синтеза белков и сборки новых фаговых частиц. В современных лабораториях на эту работу уйдет всего несколько дней.
Генетические модификации применяют, чтобы изменить специфичность фагов и повысить эффективность их терапевтического действия. Для этого наиболее агрессивные фаги снабжают узнающими структурами, связывающими их с целевыми бактериями. Также в вирусные геномы дополнительно встраивают гены, кодирующие токсические для бактерий белки, нарушающие метаболизм, - такие фаги более смертоносны для бактерий.
Бактерии имеют несколько механизмов защиты от антибиотиков и бактериофагов , один из которых - разрушение вирусных геномов ферментами рестрикции , действующими на определенные нуклеотидные последовательности. Для увеличения терапевтической активности фагов можно за счет вырожденности генетического кода так «переформатировать» последовательности их генов, чтобы минимизировать число нуклеотидных последовательностей, «чувствительных» к ферментам, одновременно сохранив их кодирующие свойства.
Универсальный способ защиты бактерий от всех внешних воздействий - так называемые биофильмы , пленки из ДНК, полисахаридов и белков, которые бактерии создают совместными усилиями и куда не проникают ни антибиотики, ни терапевтические белки. Такие биопленки - головная боль врачей, так как они способствуют разрушению зубной эмали, образуются на поверхности имплантов, катетеров, искусственных суставов, а также в дыхательных путях, на поверхности кожи и т. п. Для борьбы с биофильмами были сконструированы особые бактериофаги, содержащие ген, кодирующий специальный литический фермент, разрушающий бактериальные полимеры.
Ферменты «от бактериофага»
Большое число ферментов, сегодня широко использующихся в молекулярной биологии и генетической инженерии, были открыты в результате исследований бактериофагов.
Одним из таких примеров являются ферменты рестриктазы - группа бактериальных нуклеаз, расщепляющих ДНК. Еще в начале 1950-х гг. было обнаружено, что бактериофаги, выделенные из клеток одного штамма бактерий, зачастую плохо размножаются в близкородственном штамме. Обнаружение этого феномена означало, что у бактерий есть система подавления размножения вирусов (Luria & Human, 1952). В результате была открыта ферментативная система рестрикции-модификации, с помощью которой бактерии разрушали попавшую в клетку чужеродную ДНК. Выделение рестриктаз (эндонуклеаз рестрикции) дало в руки молекулярных биологов бесценный инструмент, позволивший манипулировать ДНК: встраивать одни последовательности в другие или вырезать необходимые фрагменты цепи, что в итоге привело к разработке технологии создания рекомбинантной ДНК.
Еще один широко используемый в молекулярной биологии фермент - ДНК-лигаза бактериофага Т4, которая «сшивает» «липкие» и «тупые» концы двуцепочечных молекул ДНК и РНК. А недавно появились генно-модифицированные варианты этого фермента с большей активностью.
От бактериофагов ведут свое происхождение и большинство используемых в лабораторной практике РНК-лигаз, которые «сшивают» одноцепочечные молекулы РНК и ДНК. В природе они в основном служат для починки сломанных молекул РНК. Исследователи наиболее часто используют РНК-лигазу бактериофага Т4, с помощью которой можно «пришить» одноцепочечные полинуклеотиды к РНК-молекулам, чтобы пометить их. Такой прием применяется для анализа структуры РНК, поиска мест связывания РНК с белками, олигонуклеотидного синтеза и т. д. Недавно среди рутинно используемых ферментов появились термостабильные РНК-лигазы, выделенные из бактериофагов rm378 и TS2126 (Nordberg Karlsson, et al., 2010; Hjorleifsdottir, 2014).
Из бактериофагов получены и некоторые из еще одной группы чрезвычайно важных ферментов - полимераз. Например, очень «точная» ДНК-полимераза бактериофага Т7, которая нашла применение в различных областях молекулярной биологии, таких как сайт-направленный мутагенез, но в основном ее используют для определения первичной структуры ДНК.
Химически модифицированная ДНК-полимераза фага Т7 была предложена как идеальный инструмент для секвенирования ДНК еще в 1987 г. (Tabor & Richardson, 1987). Модификация этой полимеразы увеличила эффективность ее работы в несколько раз: скорость полимеризации ДНК при этом достигает более 300 нуклеотидов в секунду, поэтому ее можно использовать для амплификации больших фрагментов ДНК. Этот фермент стал предшественником секвеназы - генно-инженерного фермента, оптимизированного для секвенирования ДНК в реакции Сэнгера. Секвеназа отличается высокой эффективностью и способностью включать в последовательность ДНК нуклеотидные аналоги, используемые для улучшения результатов секвенирования.
Происхождение от бактериофагов ведут и используемые в молекулярной биологии основные РНК-полимеразы (ДНК-зависимые РНК-полимеразы) - ферменты, которые катализируют процесс транскрипции (считывание РНК-копий с матрицы ДНК). К ним относятся SP6-, T7- и Т3-РНК-полимеразы, названные в честь соответствующих бактериофагов SP6, Т7 и Т3. Все эти ферменты используются для синтеза «в пробирке» антисмысловых РНК-транскриптов, меченых РНК-зондов и т. д.
Первым полностью секвенированным ДНК-геномом стал геном фага φ174 длиной свыше 5 тыс. нуклеотидов (Sanger et al., 1977). Эту расшифровку осуществила группа английского биохимика Ф. Сэнгера, создателя известного одноименного метода секвенирования ДНК.
Полинуклеотидкиназы катализируют перенос фосфатной группы от молекулы АТФ к 5′-концу молекулы нуклеиновой кислоты, обмен 5′-фосфатных групп или фосфорилирование 3′-концов мононуклеотидов. В лабораторной практике наибольшее распространение получила полинуклеотидкиназа бактериофага Т4. Она обычно используется в экспериментах для мечения ДНК радиоактивным изотопом фосфора. Полинуклеотидкиназа также используется для поиска сайтов рестрикции, ДНК и РНК дактилоскопии, синтеза субстратов для ДНК или РНК-лигаз.
В молекулярно-биологических экспериментах также находят широкое применение такие ферменты бактериофагов, как полинуклеотидкиназа фага Т4, обычно используемая для мечения ДНК радиоактивным изотопом фосфора, ДНК и РНК дактилоскопии и др., а также ферменты, расщепляющие ДНК, которые используются для получения одноцепочечных ДНК-матриц для секвенирования и анализа нуклеотидного полиморфизма.
Методами синтетической биологии удалось разработать и бактериофаги, вооруженные самым изощренным оружием, которое бактерии используют против самих фагов. Речь идет о бактериальных системах CRISPR-Cas , представляющих собой комплекс фермента нуклеазы, расщепляющей ДНК, и РНК-последовательности, направляющей действие этого фермента на определенный фрагмент вирусного генома. В качестве «указателя» служит кусочек фаговой ДНК, который бактерия сохраняет «на память» в специальном гене. При обнаружении внутри бактерии аналогичного фрагмента этот белково-нуклеотидный комплекс разрушает его.
Разобравшись с механизмом работы систем CRISPR-Cas, исследователи попробовали снабдить подобным «оружием» и самих фагов, для чего в их геном ввели комплекс генов, кодирующий нуклеазу и адресующие последовательности РНК, комплементарные специфическим участкам генома бактерий. «Мишенью» могут выступать гены, ответственные за множественную лекарственную устойчивость. Эксперименты увенчались полным успехом - такие фаги с большой эффективностью поражали бактерии, на которые были «настроены».
Фаговые антибиотики
В терапевтических целях фаги необязательно использовать напрямую. За миллионы лет эволюции бактериофаги разработали арсенал специфических белков - инструментов для распознавания целевых микроорганизмов и манипуляций с биополимерами жертвы, на основе которых можно создавать противобактериальные препараты. Наиболее перспективными белками такого типа являются ферменты эндолизины, которые фаги используют для разрушения клеточной стенки при выходе из бактерии. Сами по себе эти вещества являются мощными антибактериальными средствами, нетоксичными для человека. Эффективность и направленность их действия можно повысить, изменив в них адресующие структуры - белки, специфически связывающиеся с определенными бактериями.
Большинство бактерий делятся по устройству клеточной стенки на грамположительные, мембрана которых покрыта очень толстым слоем пептидогликанов, и грамотрицательные, у которых слой пептидогликана расположен между двумя мембранами. Использование природных эндолизинов особенно эффективно в случае грамположительных бактерий (стафилококков, стрептококков и др.), поскольку пептидогликановый слой у них расположен снаружи. Грамотрицательные бактерии (синегнойная палочка, сальмонеллы, кишечная палочка и др.) являются менее доступной мишенью, поскольку ферменту, чтобы добраться до внутреннего пептидогликанового слоя, необходимо проникнуть сквозь внешнюю бактериальную мембрану.
Для преодоления этой проблемы были созданы так называемые артилизины - модифицированные варианты природных эндолизинов, содержащие поликатионные или амфипатические пептиды, которые дестабилизируют внешнюю мембрану и обеспечивают доставку эндолизина непосредственно к пептидогликановому слою. Артилизины обладают высокой бактерицидной активностью и уже показали свою эффективность при лечении отитов у собак (Briers et al., 2014).
Примером модифицированного эндолизина, избирательно действующего на определенные бактерии, является препарат P128 канадской компании GangaGen Inc . Он представляет собой биологически активный фрагмент эндолизина, соединенный с лизостафином - адресующей белковой молекулой, которая связывается с поверхностью клеток стафилококков. Полученный химерный белок обладает высокой активностью против разных штаммов стафилококка, в том числе обладающих множественной лекарственной устойчивостью.
«Счетчики» бактерий
Бактериофаги служат не только разносторонним терапевтическим и «дезинфицирующим» средством, но и удобным и точным аналитическим инструментом микробиолога. К примеру, благодаря своей высокой специфичности они являются природными аналитическими реагентами для выявления бактерий определенного вида и штамма.
В простейшем варианте такого исследования в чашку Петри с питательной средой, засеянную бактериальной культурой, добавляют по капле различные диагностические бактериофаги. Если бактерия окажется чувствительной к фагу, то на этом месте бактериального «газона» образуется «бляшка» - прозрачный участок с убитыми и лизированными бактериальными клетками.
Анализируя размножение фагов в присутствии целевых бактерий, можно количественно определить численность последних. Так как количество фаговых частиц в растворе возрастет пропорционально числу содержавшихся в нем бактериальных клеток, то для оценки численности бактерий достаточно определить титр бактериофага.
Специфичность и чувствительность такой аналитической реакции достаточно высока, а сами процедуры просты в исполнении и не требуют сложного оборудования. Важно, что диагностические системы, основанные на бактериофагах, сигнализируют о наличии именно живого патогена, тогда как другие методы, такие как ПЦР и иммуноаналитические, свидетельствуют лишь о наличии биополимеров, принадлежащих этой бактерии. Такого типа диагностические методы особенно удобны для использования в экологических исследованиях, а также в пищевой индустрии и сельском хозяйстве.
Сейчас для выявления и количественного определения разных штаммов микроорганизмов применяют специальные референсные виды фагов. Очень быстрые, работающие практически в режиме реального времени аналитические системы могут быть созданы на основе генетически модифицированных бактериофагов, которые при попадании в бактериальную клетку запускают в ней синтез репортерных флуоресцирующих (или способных к люминесценции) белков, таких как люцифераза . При добавлении к подобной среде необходимых субстратов в ней будет появляться люминесцентный сигнал, величина которого соответствует содержанию бактерий в образце. Такие «меченные светом» фаги были разработаны для детекции опасных патогенов - возбудителей чумы, сибирской язвы, туберкулеза, а также инфекций растений.
Вероятно, с помощью модифицированных фагов удастся решить и давнюю задачу глобальной важности - разработать дешевые и быстрые методы детекции возбудителей туберкулеза на ранней стадии заболевания. Задача эта очень сложна, поскольку микобактерии, вызывающие туберкулез, отличаются крайне медленным ростом при культивировании в лабораторных условиях. Поэтому диагностика заболевания традиционными методами может затягиваться на срок до нескольких недель.
Фаговая технология позволяет упростить эту задачу. Суть ее в том, что к образцам анализируемой крови добавляют бактериофаг D29, способный поражать широкий спектр микобактерий. Затем бактериофаги отделяют, и образец перемешивают с быстрорастущей непатогенной культурой микобактерий, также чувствительной к этому бактериофагу. Если в крови первоначально имелись микобактерии, которые были инфицированы фагами, то в новой культуре будет также наблюдаться наработка бактериофага. Таким образом можно выявить единичные клетки микобактерий, а сам процесс диагностики с 2–3 недель сокращается до 2–5 дней (Swift & Rees, 2016).
Фаговый дисплей
В наши дни бактериофаги широко применяются также в качестве простых систем для наработки белков с заданными свойствами. Речь идет о разработанной в 1980-х гг. крайне эффективной молекулярно-селекционной методике - фаговом дисплее . Этот термин был предложен американцем Дж. Смитом, который доказал, что на основе бактериофагов кишечной палочки можно создать жизнеспособный модифицированный вирус, несущий на своей поверхности чужеродный белок. Для этого в фаговый геном внедряется соответствующий ген, который сливается с геном, кодирующим один из поверхностных вирусных белков. Такие модифицированные бактериофаги можно выделить из смеси с фагами дикого типа благодаря способности «чужого» белка связываться со специфичными антителами (Smith, 1985).
Из экспериментов Смита последовало два важных вывода: во-первых, используя технологию рекомбинантных ДНК, можно создавать огромные по разнообразию популяции численностью 10 6 –10 14 фаговых частиц, каждая из которых несет на своей поверхности разные варианты белков. Такие популяции назвали комбинаторные фаговые библиотеки . Во-вторых, выделив из популяции конкретный фаг (например, обладающий способностью связываться с определенным белком или органической молекулой), можно этот фаг размножить в бактериальных клетках и получить неограниченное число потомков с заданными свойствами.
С помощью фагового дисплея сегодня производят белки, которые могут избирательно связываться с терапевтическими мишенями, например, экспонированные на поверхности фага М13, способные узнавать и взаимодействовать с опухолевыми клетками. Роль этих белков в фаговой частице заключается в «упаковке» нуклеиновой кислоты, поэтому они хорошо подходят для создания препаратов генотерапии, только в этом случае они формируют частицу уже с терапевтической нуклеиновой кислотой.
На сегодня можно выделить два основных направления применения фагового дисплея. Технология на основе пептидов используется для исследования рецепторов и картирования сайтов связывания антител, создания иммуногенов и нановакцин, а также картирования сайтов связывания субстратов у белков-ферментов. Технология на основе белков и белковых доменов - для отбора антител с заданными свойствами, изучения белок-лигандных взаимодействий, скрининга экспрессируемых фрагментов комплементарной ДНК и направленных модификаций белков.
С помощью фагового дисплея можно вносить узнающие группировки во все виды поверхностных вирусных белков, а также в основной белок, формирующий тело бактериофага. Вводя в поверхностные белки пептиды с заданными свойствами, можно получить целый спектр ценных биотехнологических продуктов. Например, если этот пептид будет имитировать белок опасного вируса или бактерии, узнаваемый иммунной системой, то такой модифицированный бактериофаг представляет собой вакцину, которую можно просто, быстро и безопасно наработать.
Если же концевой поверхностный белок бактериофага «адресовать» на раковые клетки, а к другому поверхностному белку присоединить репортерные группы (например, флуоресцирующие или магнитные), то получится средство для обнаружения опухолей. А если к частице присоединить еще и цитотоксический препарат (а современная биоорганическая химия позволяет легко это сделать), то получится лекарство, направленно действующее на раковые клетки.
Одним из важных применений метода фагового дисплея белков является создание фаговых библиотек рекомбинантных антител, где антигенсвязывающие фрагменты иммуноглобулинов расположены на поверхности фаговых частиц fd или М13. Особый интерес представляют библиотеки антител человека, поскольку такие антитела могут быть использованы в терапии без ограничения. В последние годы только на фармацевтическом рынке США продается около полутора десятка терапевтических антител, сконструированных с использованием этого метода.
«Промышленные» фаги
Методология фагового дисплея нашла себе и совершенно неожиданное применение. Ведь бактериофаги в первую очередь являются наноразмерными частицами определенной структуры, на поверхности которых располагаются белки, которые с помощью фагового дисплея можно «снабдить» свойствами специфически связываться с нужными молекулами. Такие наночастицы открывают широчайшие возможности для создания материалов с заданной архитектурой и «умных» молекулярных наноустройств, при этом технологии их производства будут экологически чистыми.
Так как вирус представляет собой достаточно жесткую конструкцию с определенным соотношением размерностей, это обстоятельство позволяет использовать его для получения пористых наноструктур с известной площадью поверхности и нужным распределением пор в структуре. Как известно, именно площадь поверхности катализатора является критическим параметром, определяющим его эффективность. А существующие на сегодня технологии формирования на поверхности бактериофагов тончайшего слоя металлов и их оксидов позволяют получать катализаторы с чрезвычайно развитой регулярной поверхностью заданной размерности. (Lee et al., 2012).
Исследователь из Массачусетского технологического института А. Бельхер использовала бактериофаг M13 как шаблон для роста наночастиц и нанопроводов родия и никеля на поверхности оксида церия. Полученные наночастицы катализатора способствуют конвертации этанола в водород, таким образом, этот катализатор может оказаться весьма полезным для модернизации существующих и создания новых водородных топливных ячеек. Катализатор, выращенный на шаблоне вируса, отличается от аналогичного по составу «обычного» катализатора более высокой стабильностью, он менее подвержен старению и дезактивации поверхности (Nam et al. , 2012).
Путем покрытия нитчатых фагов золотом и двуокисью индия были получены электрохромные материалы - пористые нанопленки, меняющие цвет при изменении электрического поля, способные реагировать на изменение электрического поля в полтора раза быстрее известных аналогов. Подобного рода материалы перспективны для создания энергосберегающих ультратонких экранных устройств (Nam et al., 2012).
В Массачусетском технологическом институте бактериофаги стали основой для производства очень мощных и чрезвычайно компактных электрических батарей. Для этого использовали живые, генетически модифицированные фаги М13, неопасные для человека и способные присоединять к поверхности ионы различных металлов. В результате самосборки этих вирусов были получены структуры заданной конфигурации, которые при покрытии металлом сформировали достаточно длинные нанопровода, ставшие основой анода и катода. При самоформировании материала анода использовался вирус, способный присоединять золото и оксид кобальта, для катода - способный присоединять фосфат железа и серебро. Последний фаг также обладал способностью за счет молекулярного опознания «подхватывать» концы углеродной нанотрубки, что необходимо для обеспечения эффективного переноса электронов.
На основе комплексов бактериофага М13, двуокиси титана и одностенных углеродных нанотрубок были также созданы материалы для солнечных батарей (Dang et al., 2011).
Последние годы ознаменовались широкими исследованиями бактериофагов, которые находят себе все новые применения не только в терапии, но и в био- и нанотехнологиях. Их очевидным практическим результатом должно стать возникновение нового мощного направления персонализированной медицины, а также создание целого спектра технологий в пищевой промышленности, ветеринарии, сельском хозяйстве и в производстве современных материалов. Мы ждем, что второе столетие исследований бактериофагов принесет не меньше открытий, чем первое.
Литература
1.
Бактериофаги: биология и применение / Ред.: Э. Каттер, А. Сулаквелидзе. М.: Научный мир. 2012.
2.
Стент Г., Кэлиндар Р. Молекулярная генетика. М.: Мир. 1974. 614 с.
3.
Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фаговый дисплей на основе нитчатых бактериофагов: применение для отбора рекомбинантных антител // Acta Naturae
. 2009. № 3. C. 6–15.
4.
Mc Grath S., van Sinderen D. Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. Horizon Scientific Press, 2007.
38.Практическое использование бактериофагов. Фагодиагностика, фаготипирование, фаготерапия. Методы титрования бактериофагов.
Практическое применение бактериофагов. Строгая специфичность бактериофагов позволяет использовать их для фаготипирова-ния и дифференцировки бактериальных культур, а также для индикации их во внешней среде, например в водоемах.
Метод фаготипирования бактерий широко применяется в микробиологической практике. Он позволяет не только определить видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее фаготип (фаговар). Это связано с тем, что у бактерий одного и того же вида имеются рецепторы, адсорбирующие строго определенные фаги, которые затем вызывают их лизис. Использование наборов таких ти-поспецифических фагов позволяет проводить фаготипирование исследуемых культур с целью эпидемиологического анализа инфекционных заболеваний: установления источника инфекции и путей ее передачи.
Кроме того, по наличию фагов во внешней среде (водоемах) можно судить о содержании в них соответствующих бактерий, представляющих опасность для здоровья человека. Данный метод индикации патогенных бактерий также применяется в эпидемиологической практике. Его эффективность повышается при постановке реакции нарастания титра фага, которая основана на способности специфических линий фагов репродуцироваться на строго определенных бактериальных культурах. При внесении такого фага в исследуемый материал, содержащий искомый возбудитель, происходит нарастание его титра. Широкое использование реакции нарастания титра фага осложняется трудностью получения индикаторных наборов фагов и другими причинами.
Применение фагов с лечебными и профилактическими целями проводится сравнительно редко. Это связано с большим количеством отрицательных результатов, которые объясняются следующими причинами:
1) строгой специфичностью фагов, лизирующих только те клетки бактериальной популяции, которые снабжены соответствующими рецепторами, вследствие чего фагорезистентные особи, имеющиеся в каждой популяции, полностью сохраняют свою жизнеспособность;
2) широким применением более эффективных этиотропных средств - антибиотиков, не обладающих специфичностью бактериофагов.
В настоящее время препараты бактериофагов применяются для лечения дизентерии, сальмонеллеза, гнойной инфекции, вызванных антибиотико-резистентными бактериями. При этом в каждом случае предварительно определяют чувствительность выделенных возбудителей к данному препарату бактериофага.
Сальмонеллезные фаги применяются для профилактики одноименного заболевания в детских коллективах.
29 Www.Bsmu.H15.Ru
Бактериофаги, применение в медицине.
Бактериофаги. Применение в медицинской практике.
Бактериофаги - это вирусы бактерий способные специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцировать их и вызывать лизис.
Они встречаются везде, где есть бактерии - в почве, воде, кишечном тракте человека. Фагом присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам.
Морфология фагов:
Фаги различаются по форме - нитевидные, сферические, кубические, фаги, имеющие головку и хвостик (напоминают сперматозоид).
По размерам - мелкие, среднего размера и крупные.
Наиболее сложно устроены крупные фаги, состоящие из головки и хвостика. Головка имеет форму икосаэдра. Головка с помощью воротника и зонтика связана с отростком. Внутри отростка есть полый цилиндрический стержень, который сообщается с головкой, с наружи отросток имеет белковый чехол способный к сокращению, хвостовой отросток заканчивается шестиугольной базальной пластиной с короткими шипами, от которых отходят нитевидные структуры фибриллы. В пластинке и шипах содержится лизоцим. Отросток имеет 6 ворсинок, которые обеспечивают плотное прикрепление фага к бактериальной клетка. Могут встречаться фаги с несокращающимся чехлом, фаги с короткими отростками, фаги с аналогом отростка, фаги без отростка.
Химический состав:
Резистентность фагов: фаги переносят температуру 50-60°С. Выдерживают замораживание, гибнут при температуре 70С°. На них не действуют такие яды как цианид, фторид, а также хлороформ и фенол. Фаги хорошо сохраняются в запаянных ампулах, но они могут разрушаться при кипячении, действии кислот, при УФ - облучении.
Механизм взаимодействия фагов с микробной клеткой:
По взаимодействию различают вирулентные и умеренные фаги.
Вирулентные фаги - они проникают в бактериальную клетку, репродуцируются и вызывают лизис бактерий.
Для фагов с отростком и сокращающимся чехлом имеется ряд особенностей:
Эти фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл отростка при наличии соответствующих рецепторов. Затем происходит активация фермента АТФ-азы, что приводит к сокращению чехла хвостатого отростка и внедрению полого стержня в клетку. В процессе прокалывания стенок клетки участвует фермент - лизоцим.
ДНК фага проходит через полый стержень отростка и впрыскивается в клетку. Капсид и отросток остаются на поверхности клетки. Затем происходит репродукция белка и нуклеиновой кислоты фага внутри клетки. Следующая стадия заключается в сборке и формирование зрелых частиц фага. Заключительная стадия: лизис клетки и выход зрелых частиц фага из нее. Лизис может проходить как изнутри - происходит разрыв клеточной стенки и выход зрелых фагов во внешнею среду и извне - фаги проделывают в клеточной стенки множество отверстий, через которые вытекает содержимое клетки, при таком лизисе фаг не размножается.
Умеренные фаги - лизируют не все клетки в популяции, с частью клеток вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому клетки. В этом случае геном фага называется - профаг.
Профаг становится частью хромосомы клетки и при её размножении реплицируется синхронно с геномом клетки, не вызывая её лизис и передается потомству.
Явление симбиоза микробной клетки с профагом называется - лизогенией.
А культура бактерий содержащих профаг -лизогенной, это название отражает способность профага самопроизвольно или под действием факторов окружающей среды переходить в цитоплазму и вести себя как вирулентный фаг лизирующий бактерии. При переходе в вирулентную форму умеренный фаг может захватывать часть хромосомы бактериальной клетки и при лизисе перенести в другую.
По спектру действия фаги подразделяются:
1.Поливалентные - лизируют родственные бактерии (сальмонеллезный фаг лизирует только сальмонеллы).
2.Видовые (монофаги) - лизируют бактерии только одного вида.
3.Типоспецифические - избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида (патог. Стафилококк - 33 набора).
Препараты фагов применяют для лечения и профилактике инфекций и их диагностики. Действие фагов основано на их строгой специфичности, для получения препарата фага используют производственные штаммы и соответствующие культуры бактерий.
Формы выпуска: жидкие, сухие, в виде таблеток, аэрозолей, свечи. Вводятся в организм парентерально, энтерально и местно. Используют с лечебно - профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерии, холеры, различные гнойно - воспалительные заболевания).
Фагодиагностика: принцип диагностики основан на совместном культивировании тест - культур с известными и неизвестными фагами, положительным считается результат при наличии лизиса бактериальной клетки. Лизис может наблюдаться на жидких и плотных питательных средах. На жидких питательных средах, проявляется просветления бактериальной суспензии, а на плотных формируются участки отсутствия роста.
Фаготипирование: определение типового варианта вида с помощью набора типовых фагов. Выпускаются брюшнотифозные фаги, фаги для диагностики холеры, сальмонеллезные фаги, дизентерийные фаги. Фаготипирование необходимо при проведении эпидемиологического анализа заболевания и с целью установления источника и путей передачи. По обнаружению фага судят о содержании соответствующих микроорганизмов.
